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α-半乳糖苷酶（α-GAL）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

貨號(hào)：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

微量法

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 2.5mL 雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 4mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體 1mL×1 支，4℃保存，5μmol/mL 對(duì)硝基苯酚溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能專(zhuān)一地催化α半乳糖苷鍵的水解，主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL

對(duì)于植物種子的萌發(fā)至關(guān)重要，種子萌發(fā)初期，其催化產(chǎn)生的 D-半乳糖通過(guò)糖酵解途徑迅速轉(zhuǎn)化和消耗，為種子的萌發(fā)提供最初的能量來(lái)源，后期則主要參與細(xì)胞壁儲(chǔ)藏多糖水解。

α-GAL 分解對(duì)-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GAL 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù)30 次），15000g，4℃，離心 20 分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織的處理：稱(chēng)取約 0.2g 組織，加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿；15000g，4℃，離心 20 分鐘， 取上清，置冰上待測(cè)。

3、標(biāo)準(zhǔn)液的處理：用蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至 200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL.

二、測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定，（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑）：

充分混勻， 400nm 處測(cè)定吸光值 A，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。三、α-GAL 活性計(jì)算：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度（x，減去濃度為 0 的標(biāo)準(zhǔn)管 OD 值）和濃度（y，nmol/mL）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將△A 帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品生成的產(chǎn)物量（nmol/mL）。

1.按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol  對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=14×y÷Cpr 需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

2.按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g  組織每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GAL 活力(nmol/h /g 鮮重)＝(y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=14×y ÷W

3.按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1  萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GAL 活力(nmol/h /104 cell)= (y×V 反總)÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.028×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.07mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。

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