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細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)

操作前準(zhǔn)備工作：

1.玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒：1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上；2)干烤消毒140度2小時(shí)以上；

2.無菌工作臺(tái)先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上；各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上；

3.培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗(yàn)：將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置-20度保存；

4.消化液(pH7.8)或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存；

5.各種凍存的液體復(fù)溫時(shí)應(yīng)邊搖邊融化，否則有的液體（特別是培養(yǎng)基）容易產(chǎn)生沉淀；

6.培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來菌）至少每月一次；

7.進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無菌臺(tái)內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數(shù)量較多，培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離，開瓶（蓋）時(shí)應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒，開開后應(yīng)用燈先燒口，然后燒蓋用完后同樣操作，整個(gè)操作過程盡量在無菌臺(tái)靠里面一點(diǎn)。

復(fù)蘇：

1.應(yīng)遵守慢凍快融的原則，先將水溫鍋調(diào)至37-37.5度，取出凍存的細(xì)胞迅速放入后交細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化；

2.在無菌臺(tái)內(nèi)將完全培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶內(nèi)，約5ml左右，然后用無菌吸管從凍存管內(nèi)取出細(xì)胞，置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃，使細(xì)胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

傳代：

1.貼壁細(xì)胞：

對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸（倒）盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強(qiáng)度減弱，50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約0.6ml，按此比例進(jìn)行消化，（根據(jù)配制強(qiáng)度經(jīng)驗(yàn)），晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2分鐘，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。

2.懸浮細(xì)胞：

一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度可先離心500rpm，5min后加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

無菌操作：

簡要介紹：

1.將試驗(yàn)用品放入超凈工作臺(tái)用紫外線照射30分鐘；2. 照射30分鐘后，進(jìn)入緩沖間，換滅菌的無菌衣，換專用拖鞋；3.手部用5％的潔爾滅浸泡2分鐘，進(jìn)入潔凈區(qū)后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作時(shí)盡量靠近火焰；6.裝培養(yǎng)基的瓶子等不要直接口向上，用一個(gè)架子斜放，瓶口朝向火焰；7.標(biāo)準(zhǔn)操作，不要讓無菌吸管到處碰來碰去；8.中途出入無菌室，再次操作時(shí)，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。

活細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1、先消化吹打使細(xì)胞盡量變成單細(xì)胞懸液；

2、取出細(xì)胞液按你的濃度加入臺(tái)盼蘭置室溫5分鐘左右；

3、準(zhǔn)備好潔凈的計(jì)數(shù)板及蓋玻片放在一旁，用玻璃滴管吸取染好并輕輕吹勻的細(xì)胞液，將滴管尖端輕輕靠在蓋玻與計(jì)數(shù)板的縫隙間，微微捏一下滴管膠頭細(xì)胞自動(dòng)就被吸到計(jì)數(shù)板里了（捏重了細(xì)胞不均勻，計(jì)數(shù)不準(zhǔn)，細(xì)胞還會(huì)流出）。

4、在鏡下計(jì)數(shù)。

四角的4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)÷4×10000=你滴入時(shí)細(xì)胞液每ml的細(xì)胞數(shù)。

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